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单链DNA Ladder(10～75nt)由9种不同长度的单链DNA分子混合而成，已经含有上样缓冲液，使用前70℃处理5分钟后可以直接上样，本单链DNA Ladder适用于跑尿素变性胶。产品内附带2×TBE尿素上样缓冲液，方便待检样品的上样。

单链DNA Ladder(10～75nt)的9个条带的大小为10、15、20、25、30、35、40、50、75nt。35nt浓度约为100ng/μL，其余条带浓度约为50ng/μL。

15%尿素变性胶分离单链DNA
lane 1～9分别为10、15、20、25、30、35、40、50、75nt ssDNA上样量为0.5μg
lane 10：单链DNA Ladder(20～75nt)，货号：RFT202，预混型，上样量5μL
lane 11：单链DNA Ladder(20～75nt)，货号：RFT418，非预混型，配制后上样量5μL
lane 12：单链DNA Ladder(10～75nt)，货号：RFT419，预混型，上样量5μL
电泳条件：1×TBE，恒压200 V 50min
染色：RealGood Red后染20min，紫外激发

组分	规格	保存
单链DNA Ladder(10～75nt)	125μL	-20℃
2×TBE尿素上样缓冲液	1mL	4℃或-20℃

保存：-20℃，有效期2年。

• 为了方便待检样品的上样，产品内附带2×TBE尿素上样缓冲液。
  
• 以每次上样5μL计算，本制品可以使用大约25次。
  
• 单链DNA Ladder(10～75nt)产品适用于变性PAGE垂直电泳，不适用于水平琼脂糖凝胶电泳。

以下使用方法均以8×10cm凝胶厚1.0mm示例，其他规格凝胶请适当调整。

• 凝胶制备：
  
  • 可以选择DNA尿素PAGE电泳试剂盒或按照以下程序制胶：
    表一：TBE-尿素PAGE分离胶配方表(总体积5mL，适用于厚度1.0mm小板胶)
    

    单链DNA长度	最佳凝胶浓度	尿素	40%PAA(29:1)	10×TBE	灭菌水	10%APS	TEMED
    200～1000nt	5%	2.1g	0.625mL	0.5mL	至5mL	50μL	5μL
    50～400nt	8%		1mL
    30～300nt	10%		1.25mL
    10～150nt	15%		1.875mL
    5～120nt	20%		2.5mL

  • 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水层，使凝胶表面保持平整。
    
  • 静置10～20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
    
    • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
  • 去除覆盖在分离胶上的水层；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
    表二：TBE-尿素PAGE 4%浓缩配方表(总体积2mL，适用于1.0mm厚度胶)
    

    凝胶浓度	尿素	40%PAA(29:1)	10×TBE	灭菌水	10%APS	TEMED
    4%	0.84g	0.2mL	0.2mL	至2mL	20μL	2μL

  • 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
    
  • 静置30～60分钟，等待浓缩胶聚合。
    
    • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
• 样品制备：
  取适量体积单链DNA Ladder样品（不用添加上样缓冲液）；待测样品与等体积的2×TBE尿素上样缓冲液混合，70℃处理5分钟，冰浴制冷后待上样。
  
• 电泳：
  
  • 预电泳（可选）：电泳槽内外加入适量1×TBE缓冲液稳压200V预电泳30分钟。电泳结束后，用1×TBE缓冲液彻底冲洗加样孔2～3次，去除残余的尿素。
    
  • 上样：根据梳齿确定Marker上样量，一般是10齿1mm厚梳子上样5μL，15齿1mm厚梳子上样3μL。
    
  • 连接电源线，打开电源开关，按照以下条件电泳。
    

    	恒电压	起始电流	结束电流	电泳时间	适用条件
    推荐电压	200V	15～20mA/板胶	10～15mA/板胶	60+ min	最佳电压，最优的分辨率

  • 等待上样缓冲液的溴酚蓝指示前沿到凝胶底部时终止电泳，取出凝胶进行后续实验。
    

    变性胶浓度	溴酚蓝	二甲苯菁
    5%	~35nt	~130nt
    8%	~19nt	~75nt
    10%	~15nt	~55nt
    15%	~10nt	~52nt
    20%	~8nt	~35nt

• 染色：
  
  • 用单链DNA PAGE电泳染色试剂盒(货号：RFT204)，核酸PAGE电泳染色试剂盒(货号：RFT205)或核酸快速染色试剂盒(货号：RFT206)染色均可以得到清晰的条带分离效果。
    
  • 如果使用核酸染料染色，RealGood Red(货号：RFT232)或RealGood All(货号：RFT270)核酸染料结合单链核酸效果最佳，强烈建议使用以便获得最佳效果的胶图。其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。

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